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LC-NMR/MS联用系统

液相色谱(Liquid Chromatography,LC)-核磁共振(Nuclear Magenetic Resonance,NMR)/质谱(Mass spectrometry,MS)联用系统,是21世纪以来现代分析化学联用技术发展的重要成果。该联用技术整合了高效液相色谱对复杂样品体系中有机化合物高效分离、质谱对有机化合物的高效灵敏检测以及核磁共振技术对有机化合物强大的结构解析能力等优点,该技术自推出以来,已被成功用于天然产物化学、药物杂质定性分析能研究领域。众多成功的案例显示该技术强大的分析能力,以及广阔的应用前景。

目前,液相色谱、质谱和核磁共振是现代分析化学的重要分析技术,商品化的谱仪已广泛用于科学研究、工业生产的产品质量控制与质量监管等领域。液相色谱仪、液相色谱-质谱联用和核磁共振谱仪通常安装在不同的实验室,作为不同的仪器系统单独使用。

 

图1 LC-NMR/MS联用系统构造图

在仪器配置上,现代LC-NMR/MS联用系统由高效液相色谱系统(LC)、在线固相萃取(SPE)、质谱(MS)与核磁共振(NMR)等四个独立的仪器组成。在实际使用中,可根据研究目的和不同实验需求分别进入LC、NMR、LC-MS、LC-DAD-SPE-NMR、LC-SPE-NMR/MS等工作模式,从而发挥不同的实验效能。

LC-NMR/MS联用系统实际上中四种谱仪的组合。除在线固相萃取仪相对少见外,液相色谱和质谱仪与常规实验室的谱仪完全相同,仅核磁共振在配置上有差异。因超低温探头较常温探头具有更高的灵敏度,因此本LC-NMR/MS联用系统推荐使用配备超灵敏低温探头的核磁共振谱仪,以及适用于联用使用的插件。理论上讲,在配备超低温探头核磁共振谱仪的实验室,增加在线固相萃取仪和联用插件等配置,可将现有设备扩展为LC-DAD-SPE-NMR联用。

目前LC-NMR/MS联用系统主要用于复杂样品体系中微量组分的定性分析,如药物中微量杂质分析,植物化学等研究领域。

LC-NMR/MS联用系统的实验应用一般遵循以下程序。1、建立重现性良好的复杂样品体系的液相色谱分离方法,让尽可能多的色谱峰可到良好分离。2、采用LC-MS工作模式以优化后的液相色谱条件对复杂样品进行分析,结合文献及标准品对色谱中色谱峰进行初步化学结构推测,包括已知和未知的色谱峰。3、采用LC-DAD-SPE-NMR模式,对需要NMR数据进行有机化学结构解析的色谱峰进行进行多次固相萃取(SPE)。根据化合物性质的差异,选用不同吸附填料的固相萃取柱。4、氮气吹干萃取目标色谱峰的固相萃取柱,然后以氘代试剂(如CD3CN)洗脱固相萃取柱,并通过毛细管将溶解有目标组分的溶液转移至核磁谱仪内。5、对样品溶液进行NMR测试,包括一维与二维NMR谱的采集。6、MS和NMR数据综合解析色谱峰化学结构。此程序适用于药物研究领域主要用于微量杂质组分的定性分析。

在植物化学研究领域,LC-NMR/MS系统还有扩展性的应用。通过LC-DAD-SPE-NMR实验,鉴定色谱中强度较高的色谱峰化学结构。对确定结构的色谱峰进行质谱分析(二级质谱),了解化合物的质谱特征(质谱裂解规律)。根据掌握的化合物质谱特征对更低强度的同类型化合物的色谱峰进行基于质谱技术的结构鉴定,更充分地认识植物化学成分,有助于植物化学的深入研究。

LC-NMR/MS联用系统购置费用高,对实验操作人员的实验技能较高,限制了该技术的应用。该联用系统购置费用高昂,常规实验室难以承受。最重要的是该联用系统对实验操作人员要求较高,要求实验人员具有液相色谱、质谱和核磁共振波谱学基本理论知识,熟练质谱和核磁共振波谱实验技能,以及利用质谱和核磁共振波谱进行化学结构解析的能力。

实验案例1 卡巴它赛降解杂质结构分析

卡巴它赛注射液微量杂质分析。卡巴它赛是治疗前列腺癌的一种化学半合成紫杉烷类化合物,最早由赛诺菲公司研发,于2010年6月获美国FDA批准上市。某制药公司在仿制该药的过程中,在注射液质量控制阶段中发现未知杂质色谱峰,而原料药中并无该杂质峰,初步判断为生产工艺中产生该杂质。采用高分辨质谱技术发现,未知杂质色谱峰与API卡巴它赛具有质量分子量,判断为同分异构体,但查阅文献未见该杂质的任何文献报道。最终,采用LC-NMR/MS联用技术,采集一维与二维NMR谱,确定杂质结构,推测为卡巴它赛中六元环重排产生的杂质。

图2 卡巴它赛注射液液相色谱图